Welche Signalverstärkungsstrategie ist die empfindlichste für den Nachweis von Entzündungen?
BAM entwickelt einen schnelleren und einfacheren Ansatz zur Signalverstärkung für Diagnostikverfahren
Zum Nachweis von Molekülen wie krankheitsrelevanter Biomarker oder Schadstoffen in der Umwelt und in der medizinischen Diagnostik werden Immunoassays verwendet. Diese bioanalytische Testmethode beruht auf der spezifischen Bindung zwischen dem zu detektierenden Molekül und Antikörpern, welche eine hohe Spezifität für das Zielmolekül aufweisen. In den meisten Immunoassays wird entweder das Molekül oder der Antikörper mit einem Reporter versehen, um ein messbares Signal zu erzeugen, das dann z.B. mit optischen Methoden ausgelesen wird. Die gebräuchlichste Variante ist die Markierung mit Enzymen, die die Umsetzung eines zugesetzten Substrates in ein optisch auslesbares Produkt katalysieren. Inzwischen spielt die direkte Markierung mit fluoreszenten Farbstoffen eine immer größere Rolle, um solche Assays zu vereinfachen. Über die gemessene Signalintensität des Reporters wird dann die Konzentration des Zielmoleküls in der Probe bestimmt. Für den Nachweis sehr niedriger Konzentrationen muss die Signalstärke möglichst hoch sein für zuverlässige Messungen und Quantifizierungen.
Dafür wurden verschiedene Signalverstärkungsstrategien für fluoreszente Reporter entwickelt. In unserer Arbeit haben wir diese Strategien für den Nachweis des Entzündungsmarker C-reaktives Protein (CRP) optimiert und miteinander verglichen. Ein Schlüssel für eine hohe Signalstärke ist die Markierung mit einer großen Anzahl an Farbstoffmolekülen, die sich in einem Nanopartikel befinden, der an einen Antikörper gebunden wird. Die hohe Beladungsdichte des Nanopartikels kann aber zu einer Löschung der Fluoreszenzintensität führen. Unser neuer Ansatz ist hier die Freisetzung der Farbstoffmoleküle nach erfolgreicher Bindung des Zielmoleküls mit dem Antikörper durch das Auflösen des Nanopartikels. Parameter wie Reporterkonzentration im Nanopartikel und die Partikelgröße sind dabei entscheidend für eine möglichst hohe Signalverstärkung und sehr niedrige Nachweisgrenzen.
Dieses Prinzip wurde für den fluoreszenten Reporter Coumarin 153 und für Hemin untersucht. Hemin katalysiert eine chemische Reaktion, die zum Leuchten des Farbstoffs Luminol führt. Letzterer Ansatz ermöglichte mit der neuen Signalverstärkungsstrategie vergleichbare Nachweisgrenzen wie der in klinischen Untersuchungen verwendete enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA). Der von uns entwickelte Ansatz ist jedoch schneller und einfacher und für zuverlässige Messungen außerhalb von hochspezialisierten Laboren ausgelegt.
Publikation:
Exploring Simple Particle-Based Signal Amplification Strategies in a Heterogeneous Sandwich Immunoassay with Optical Detection
Daniel Geißler, K. David Wegner, Christin Fischer, and Ute Resch-Genger
Analytical Chemistry 2024 96 (13), 5078-5085. DOI:10.1021/acs.analchem.3c03691
Kontakt:
Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM)
Dr. rer. nat. Ute Resch-Genger
Leiterin Biophotonik
+49 30 8104-1134
Ute.Resch(at)bam.de
Paper des Monats der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM) vom 01.12.2024